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[广告贴] 超快基因敲除细胞系构建流程,干货

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发表于 2020-12-6 20:23 | 显示全部楼层 |阅读模式
 科学家在做细胞基因敲除之前会基因敲低,但由于shRNA技术本身的限制,无法得到基因功能完全缺失的细胞(一般shRNA约为70%敲除),甚至经常发生shRNA敲低了,但细胞WB效果不好;同时Knockout也会出现使用码移敲除导致敲除不干净的问题!所以最后我们会选择细胞基因敲除(大片段敲除)的方法,彻底敲除基因的蛋白质功能。如何才能高效敲除细胞基因的大片段?我们将在下面说明周期和方法:

  1、选择悬浮细胞培养、细胞敲除载体构建:

  我们选择1-10kb的片段大小进行敲除,这个效率比较合适;一般选择能非3倍数外显子比较好。如果没有,问题也不大,只能选择大片段来做了;

  可以设计合成Dual-gRNA,通过PCR将目的gRNA构建到敲除载体中,测序:

  细胞的制备和转染:

  我们一般采用电转构建敲除细胞系

  A、脂质体参考各公司说明书;

  B、如果用电转,效率会高1倍;

  使用我们专有的VIRUS-Free技术,其效率与使用病毒的效率相当(但周期缩短了一半)。

  电转后,经过3天的药物筛选,可以制造单克隆:

  A、单克隆环法:此类方法其优点在于工作量小,只需将转染或者病毒载体感染后的细胞按照一定的细胞密度转移至新皿中,并使用合适的药物进行筛选,最后在克隆环的帮助下对单克隆细胞株进行挑选,并在新皿中完成扩增。缺点在于需要对细胞密度和药物浓度绘制致死曲线并选取合适的细胞密度和药物浓度进行筛选,一些细小的密度和浓度差别都会导致难以获取均一的单克隆,结果导致获取的克隆不纯,含有非整合的细胞。稳定整合的细胞在这样一类混合细胞中,很快会失去生长优势,最终导致失去稳定株。

  B、ClonePlus技术:是我们研发的专用高效细胞敲除技能,主要经过高通量电转体系和高通量的克隆分选技能结合,获得基因修改的单细胞,其克隆构成率能够达98%,就算是克隆构成率低的细胞株也能获得敲除单克隆。【7-10天能够完结绝大部分的细胞的单克隆工作】

  PCR判定与扩增:

  将获得的单克隆在96孔中传代,并将细胞进行PCR判定,由于我们使用大片段敲除,能够直接进行PCR判定,无需杂乱的测序和读图判定过程;所以一般2天完成判定过程,然后就能够将克隆细胞直接进行直接扩增,交给后面做RT-PCR检测,保证其mRNA的完全敲除。
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